| Q 培地と添加物 A 粉末および液体培地の組成成分表はホームページ上などで通常公開されていますので容易に入手が可能です。一般的に良く使用されているHam's F12培地やDMEM, RPMI1640, MCDB培地 および、これらの組み合わせからなる基礎培地は、トリプシン-EDTAやPBSなどと同様に、様々な製造元から入手することが可能です。市販の調整済み培地を使うかどうかは、研究者の方が予算や製品の品質、およびその製品自体を信頼されるかどうかにより異なります。特種な培地は、特別注文品として入手することも可能ですが、大量のオーダーとなるのが一般的です。（例えば100Lもしくはそれ以上のスケール）。 液体培地は出荷前の段階で保存されている期間がすでに経過していることから、液体培地として購入されるよりもより粉末状態から調整される培地のほうが良いでしょう。研究室でお手持ちの試薬類で自家調整される場合には、保存期限や溶解性について理解しなければならないため、これらの試薬類について報告がなされているオリジナルの論文を参照して調整しなければなりません。細胞培養用試薬のいくつかは、標準グレードの安価なものと、"cell cultureグレード "もしくは "tested for cell cultureグレード"と記載されている高価なもの、といったように、2種類のグレードのものがカタログに掲載されており、後者の記載がなされている製品のほうがより良いと言えます。これは、あまり近年問題になってはいないようですが、たとえば初期の工業的な大量生産がおこなわれていた際供給されていたHEPESバッファーで、細胞毒性を示す物質の混入レベルが一定でなかったことがありました。少なくとも、試薬グレードで供給されている商品を使用していただくべきであり、これは例えばpH調整のために使用する塩化ナトリウムや水酸化ナトリウムが低品質の商品であった場合に、鉛の混入レベルが細胞に対する毒性となり影響を与えることがあるからです。 細胞培養用の全ての試薬調整において、HPLCグレードの水を使用されることを推奨いたします。HPLCグレードの水を精製できるフィルタ−装置はたくさん市販されており入手が可能となっています。ガラス蒸留装置で3回蒸留を行った水でも可能ですが、3日以内に使用してください。藻類はどこにでも成育することができ、その藻から他の微生物が栄養を取る、というように生態系はとても早く発達してしまうので、長期間保存していた精製水は使用しないでください。 大容量でフィルタ−精製する場合、ポンプもしくは圧力をかける装置を使用することが可能です。この装置の使用にはある程度の設備または滅菌を必要としますが、濾過する培地量が一般的には4リットルを上回るかどうかで使用する価値があるシステムであるかどうかを判断します。または、消耗品として市販されているプラスチック製のフィルタ−システムを使用することも可能です。 血清はいくつかの会社から入手することが可能で、バッチごとに変化するのが一般的です。このため、ご使用される細胞に対し、事前確認試験のためバッチごと血清の評価を実施するということは一般的な作業であります。 血清は-70℃〜-90℃であれば長期保存することが可能です。いくつかの血清ロットにおいては、一般的な構成成分の分析結果が付与されていますが、もちろん分析されていない構成成分も存在し、これらについては示されてはいません。ます。血清も含めた市販の試薬類などの滅菌性については、疑いを持ってお取扱いいただくほうが良いでしょう。 血清を含む培地を使用する場合、ご自身で濾過して作成しておいた無菌であろうと思われる血清を培地添加されるより、念のために使用される直前にフィルター滅菌して用いると安全です。濾過滅菌後の培地を確認するため、抗生物質が添加されていない大容量培地、もしくはLB寒天培地にその培地を少量入れて数日間培養することで、滅菌性試験を実施していただくことが可能です。一般的には、可能であれば100-200ml容量の容器に液体培地を保存しておくことを推奨いたします。血清を含むほとんどの培地がこのように保存可能ですが、無血清培地の場合にはCa+, Mg+が高濃度に含まれるため、凍結時に沈殿物が産生されてしまいます。 冷蔵保存されていた液体培地は、37℃のウォーターバスで10-15分程度温めてください。もし凍結されている状態であれば、培地を解凍機能に設定した電子レンジ波で2〜3分間解凍することも可能です。超低温で保存されていたガラスボトルの血清を溶解する場合には十分ご注意ください。ボトルの破裂を防ぐため、まずガラスボトルは-20℃で2時間置き、その後4℃で1時間置き、続いて37℃のウォーターバスで溶解するようにして下さい。細胞培養に使用される全ての試薬類は、細胞に加える前に温めた状態で長時間放置せず、最低限に留めてください。 過去20年間の細胞培養技術の革新により、血清の代わりに精製された成長因子やホルモンが添加されるようになりました。いくつかのホルモンが市販されており、比較的安価に購入� ��ることが可能ですが、その他、特にペプチド成長因子については従来から高価でした。組換え体やペプチド合成における近年の大量生産技術の進化により、これらの価格は下がってきました。これらの添加物は一般的には後々培地に加えて使用するまでは濾過して保存しておくべきであり、血清のように培地に直接加えて保存すべきではありません。安定性の問題により、ほとんどの無血清培地用の添加物は高濃度で保存されている溶液の状態で、細胞播種後の個々の培養プレートやフラスコに対して、その使用培地容量に相当する量を直接添加するほうがよいと言われています。成長因子ペプチドのほとんどが滅菌された乾燥粉末の状態で市販されており、滅菌水もしくは供給元が指定する塩化バッファーで膨潤して使用することが可� �です。ほとんどの添加物は凍結状態で長期保存が可能ですが、繰り返しの凍結融解は避けてください。 | | Q Media and reagents A Powdered and liquid media formulations are available commercially. Commonly used basal medium formulations such as Ham's F12, Dulbecco-modified Eagle's medium, RPMI 1640, MCDB media and combinations of these media, as well as sterile solutions of trypsin-EDTA, PBS etc. are available from multiple sources. The degree to which an investigator chooses to use commercially-prepared solutions depends on budgets and the degree of faith in the quality and consistency of the product. Unusual medium formulations can be obtained by special order, but usually in large lots only (eg., 100 liters or more). Making media fresh from a powdered formulation is preferable to buying liquid media, because the liquids have undergone a period of storage prior to shipping. If medium is made from laboratory chemicals, it is imperative that the original papers reporting these formulations be consulted, because an understanding of storage stability and solubility of stock components is essential. Some cell culture-related chemicals appear in catalogues in two grades: a cheaper standard grade and a more expensive "cell culture " or "tested for cell culture" grade. This issue may have some merit; for example, early industrial batches of HEPES buffer, were inconsistent in levels of contaminants toxic to cultured cells, but this particular problem has not been of recent concern. At the least, reagent grade materials should be used; contaminating levels of lead, for instance, in poor quality NaCl or NaOH used for adjusting medium pH can contribute to cell toxicity. For all cell culture reagents, HPLC-grade water is recommended. A number of filtration systems to produce HPLC-grade water are commercially available. Triple glass distillation is also fine, but less used these days. Storage of water purified earlier is not recommended, because even minimal microbial growth upon storage can lead to pyrogen contamination of the water. Algae can grow anywhere, and an ecosystem in which other microorganisms benefit from the algae can quickly develop. For large scale filtration, pump-driven or pressure-driven devices are available. These require some degree of assembly or sterilization and might be considered worthwhile of if the volume of medium to filter routinely exceeds 4 liters. Otherwise, disposable, sterile, plastic vacuum filtration devises may be used. Serum is available from multiple companies, and batch to batch variation is the rule. It is common practice to request prior to purchase samples of various serum batches for testing with the particular cell system of interest. Serum can be stored long term at -70 to -90oC. Some serum lots are provided with an analysis of components of presumed general interest; of course this gives no insight regarding the components that are not assayed. It is recommended that sterility of any commercial solution, including serum, be treated with skepticism. In situations in which serum-containing medium is used, a relatively safe approach is to filter the serum-containing medium as the last step, rather than adding presumed sterile serum to medium you have filtered. Medium can be tested for sterility after filtration by inoculation of a small volume into a larger volume of antibiotic-free medium and incubation for a few days, or by inoculation onto antibiotic-free LB agar plates. In general, it is recommended to store liquid medium frozen in 100-200 ml aliquots if possible. Most serum-containing media can be stored this way, but some serum-free media can precipitate upon freezing because of relatively high calcium and phosphate concentrations. Liquid medium stored in the refrigerator may be warmed in a 37oC water bath for 10-15 minutes. If frozen, medium can be thawed in microwave for a few minutes on defrost setting. Glass bottles of serum stored at very low temperatures can present a problem when thawing. To prevent breaking the bottle, first place bottle at -20oC for 2 hours, then 4oC for 1 hour, then into a 37oC water bath. It is good practice to minimize the time any cell culture reagent is maintained in a warm environment prior to exposing to cells, because some of the relevant components are heat sensitive Advances in cell culture in the last two decades have been made by supplementing or replacing serum with purified growth factors or hormones. Although some of the hormones are relatively cheap commercially, others, particularly the peptide growth factors, traditionally have been quite expensive. Recent progress in large scale production of recombinant products and peptide synthesis has led to price reductions for some of these. Unlike the approach one might routinely take with a serum supplement, these supplements generally should not be added directly to the medium, filtered and then the medium stored for later use. Stability problems dictate that most serum-free supplements are best added directly to medium in individual plates or flasks as small aliquots from concentrated stocks immediately after plating cells. Many peptide growth factors may be obtained as sterile, lyophilized powders from commercial sources and re-constituted with sterile water or buffered salt solutions as indicated by the vendors. Store sterile stock solutions of supplements in the refrigerator. Supplements may be stored long-term in the freezer in aliquots. Multiple freeze-thaws should be avoided.
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| Q 細胞培養用のプラスチック容器とガラス容器 A 予算があるならば、使い捨てのプラスチック製容器を使用してください。特に無血清培地で培養しなければならない細胞は、研究室の予算が許す限りプラスチック製の使い捨てタイプ容器を使用されることを推奨します。これは、ガラス容器専用の市販の洗剤は存在するものの、そのガラス容器を再利用した際に残在した溶剤が細胞に対し毒性を示すので、再現性が保証できるまで十分に洗浄するためにはかなりの労力と時間がかかる作業であるからです。 市販のプラスチック製培養容器は、接着もしくは初代培養用の細胞などの用途に用いられるため、化学的もしくは物理的な機能を有するように表面加工がなされています。これら容器はそれぞれの細胞培養システムに対して試験がなされています。しかしながら、これら細胞� ��養用の容器は、出荷の際や製造の段階において稀にダメージを受けていることがあり、視覚的に簡単に判別することができないことから、ある程度の品質に対する信頼性にも疑問が生じることもあります。もし微生物のコンタミがあった場合には、プラスチック容器自体の汚染原因も考慮に入れるべきでしょう。メーカーから市販されているプラスチック容器では、時々ほとんどの用途ではほぼ問題なく使用することが出来たのに、あるいくつかの細胞にとっては予測しなかった影響を与えるという変化もあるようです。 個別包装された滅菌済み綿栓プラスチックピペットは、細胞培養用のクリーンベンチ内での無菌作業には必要不可欠ですが、必要時にのみ使うべきであることを研究所のメンバーに対して認識してもらうことはコ� ��ト面において有効でしょう。滅菌された状態が必要ない作業では非包装のプラスチックピペットやガラス製の使い捨てピペットの使用が可能です。またこれと同様に、ピペットのサイズによりコストが異なるので、適切なサイズのピペットを使用することも効果的です。使い捨てのガラス製滅菌済み綿栓パスツールピペットは、価格も安く少量の作業の際にも使い勝手が良いでしょう。培地を作成した際に使用されたフラスコやシリンダー、混和棒、培地を保存していたガラスボトルなどは、使用後は直ぐにすすぎ洗いし、洗剤は使用せずにHPLCグレードの水で洗浄してください。細胞培養用に使用されるガラス容器は、過去に他の用途で使用されていないものを用いるようにしてください。 | | Q Cell culture plasticware and glassware A It is recommended to use plastic, disposable cell culture materials as much at the budget will allow. This is particularly true for serum-free cell culture. It is difficult and time consuming to wash reusable glassware sufficiently free of toxic detergent to guarantee reproducible success when using these in cell culture, although detergents sold commercially for use with cell culture glassware improve this situation. Some commercially available plasticware is advertised to have been chemically or physically altered to improve certain functions, such as adhesion or growth of primary cultures; these must be tested individually for each cell culture system. Cell culture vessels occasionally are damaged in shipping or improperly manufactured so that integrity is compromised in a way that is not immediately obvious visually. If microbial contamination suddenly appears, do not discount the possibility that the plasticware is faulty. Plastic formulations used by the commercial suppliers may change from time to time in ways that may be insignificant for the vast majority of user but may have unpredicted effects for some cell culture systems. It may be useful to impress upon laboratory personnel that sterile, cotton-plugged, individually wrapped plastic pipettes are essential for sterile work in the cell culture hood, but should only be used when necessary. Unwrapped plastic pipets or glass disposable pipets are available for nonsterile manipulations. Similarly, the appropriate pipette size should be used, because cost goes up with increasing size of the pipette. Sterile, disposable, cotton plugged glass Pasteur pipettes are cheap and extremely versatile for small volume work. It is recommended that flasks, graduated cylinders, stir bars, etc. used in making up medium and glass bottles used to store medium be rinsed immediately after use and washed with HPLC-grade water without soap. Glassware used for cell culture work should never have been used previously for other purposes. |
